气相色谱筛查早期肺癌还有多长的路要走

傅若农教授生于1930年，1953年结业于北京大学化学系，而后一向在北京理工大学(原北京工业学院)从事教育与科研作业。1958年，傅若农教授开端带领学生开始进入吸附柱色谱和气相色谱的探究;1966到1976年体系地阅览并翻译了两本气相色谱启蒙书，从此进入其后半生一向从事的作业——色谱研讨。傅若农教授是中国老一辈色谱研讨专家，见证了中国气相色谱研讨的开展，为中国培养了许多色谱研讨人才。

1 化学权威鲍林把气相色谱用于医学确诊

　　早在上世纪70年代初，闻名化学家鲍林在斯坦福大学任教期间，就提出用气相色谱查看呼吸气、血、尿、体液等猜测疾病的办法(Proc Nat Acad Sci USA,1971,68(10):2374-2376)，他运用32.8m x 0.76mm的不锈钢毛细管色谱柱，固定相为SF 96 硅油，以0.5℃/min从20℃程序升温到180℃,得到图 1 的色谱图：

图 1 鲍林用气相色谱剖析呼吸气体的色谱

2 前期探究GC/MS筛查肺癌

　　用呼吸气体确诊前期肺癌具有简便、无创、安全的特色，现在变成研讨热门。研讨的办法是挑选肺癌病人呼吸气体中也许的特征挥发性有机化合物(VOC s)。

　　1985年S. M. Gordon等用GC/MS查看肺癌病人呼吸气中的有机挥发性物质 (Clin Chem, 1985 ,31(8):1278-1282)，在这项研讨中，他们探讨了肺癌病人的呼吸气中也许富含共同的挥发性有机化合物，用以进行无创肺癌确诊。他们用电脑辅佐获取特征挥发性有机物，运用气相色谱/质谱和多变量核算进行剖析，搜集的14个肺癌病人的呼吸气样品。在化疗或放疗前搜集呼吸气样品，所研讨12例病人的特色总结在表1。

表 1 12名肺癌病人的情况

　　a--以一天一包的卷烟花费量核算年数

　　b—仅有一个女人

　　他们还研讨了对照组九例正常人17个样品呼气。对照组9人，年龄25岁至70岁，包含一个妇人。两个男性是很重的吸烟者，他们没有肺病或全身性疾病史。大多数是医院人员。

　　(1) 样品搜集

　　运用一个专门规划的体系搜集呼出气，用一个60 / 80目Tenax GC吸附剂管搜集呼气。如图2所示。

图 2 专门规划的搜集呼出气设备

　　把一个消毒过的 Rudolph呼吸阀连接到呼气多路连接器上，并把绷簧夹夹到人鼻子上，经过连接到阀上的呼气嘴，测验者吸入净化空气5 min，然后经过阀门再呼出到大气中。这么可尽量削减任何环境中污染物吸入肺部的影响。 把Rudolph阀连接到加热的呼气输送管，测验者要把测定的呼气送到40升采样袋。每进行两次这么的填充后，经过呼气计量器施加外部压力把样品袋排空，第三次填充的呼气作为测定样品。用呼气计量器测定通气速率。

　　(2)GC/MS呼气测定

　　用Tenax吸附管吸附呼气中的挥发性有机化合物，以后进行热脱附，以一种惰性气体流洗脱吸附管中的样品，用液氮冷却被剖析物，进行气相色谱/质谱剖析。

　　为了提高质谱数据的质量，他们对原始数据应用一种有用的谱图增强算法，来比照气相色谱/质谱数据，这一程序主动从数据中定位和获取谱线，得到一组有用谱线，即没有搅扰物的谱图，然后进行峰面积的核算，评估各个成分的浓度。在剖析前，往Tenax GC获取柱中加入内标物(全氟甲苯)。然后对谱图中的峰进行保存时刻和质谱检索。他们用了三个通用的核算程序来处理数据，从肺癌病人和对照人群中得到的297化合物中进行筛查核算。

　　成果阐明肺癌病人和对照人呼气中有区别的化合物为16个含氧化合物及4个含硫化合物。得到的总离子流图如图3。

图 3 肺癌病人(a) 正常人(b)呼气中挥发性化合物的GC/MS图

3 后续的研讨

　　(1) 1988年O,Nell等也进行相似的研讨：

　　他们研讨了8名肺癌病人，呼气搜集和Gordon等用的办法相同，GC/MS剖析：搜集在Tenax管中的挥发性有机成分经220℃热脱附，用氦气吹送到液氮冷阱中，然后被敏捷加热到250℃ 直接写入到气相色谱仪进样口。运用瓦里安3700型气相色谱仪，别离用毛细管柱为CP Wax 57CB(聚乙二醇固定相)。气相色谱和质谱剖析条件为：色谱柱在0℃坚持5 min，然后以4℃/ min程序升温到220℃。质谱剖析运用Finnigan MAT 311A 质谱仪和SpectroSystem SS-200数据体系，每2.2s扫描 m/z 20- m/z 30的谱图。

　　90%肺癌病人呼气中都富含下列挥发性化合物：己烷，甲基戊烷，三甲基庚烷，异戊烯，苯，甲苯，乙苯，甲基乙基苯，三甲基苯，苯乙烯，萘，甲基萘，丙醛，丙酮，2-丁酮，酚，苯甲醛，乙酰丙酮，壬醛，丙酸乙酯，异丁酸甲酯，二氯甲烷，二氯苯，三氯乙烷，三氯氟甲烷，四氯乙烯。

　　(2)1999年Michael Phillips 等的研讨：

　　Phillips 等 在“柳叶刀(Lancet，1999，353: 1930–33”杂志上宣布的文章为后来的研讨者广泛引证。他们也是把肺癌病人的呼吸气搜集、浓缩、解析、冷冻富集、热脱附，用GC/MS进行别离查看，查看了108个肺癌病人，发现有22种挥发性有机物是肺癌病人的生物符号物，可用以辨别前期肺癌。他们从1995年8月到1996年10月搜集108名肺癌病人的呼气进行研讨，这些病人的安排学确诊见下表2：

　　(I) 办法：实验病人在做支气管镜查看前，禁食24 h,运用相似上一节所述的呼吸气搜集设备，搜集呼吸气5 min,把10 L样品富集到活性炭吸附管中，一起搜集环境空气样品做空白实验。样品经热脱附以后再用两次冷阱富集后进行色谱/质谱剖析。

表 2 108名病人安排学确诊

(II) 成果：在呼吸气中发现有22种特征化合物，见表 3：

表 3 22种特征化合物

* 这些化合物有不确定性，奉献巨细由上到下下降

　　在2003年Michael Phillips 等又在Chest (2003, 123:2115-2123)持续宣布了用GC/MS进行肺癌病人呼气中特征有机挥发物的研讨。这次发布了他们所运用的呼气的设备，见图4：

图 4 Phillips 等运用的呼气取样设备

　　他们比照了健康的志愿者与原发性肺癌病人呼气中挥发性有机物成分的差别，构建了辨别肺癌的模型，这一模型运用刀切法(jack knife)和留一法(leave-one-out)进行穿插验证，留两个额定的测验组(没有被用来开发模型)用于验证。成果：178例肺癌病人，选用九个挥发性有机化合物的敏感性为89.6%。在穿插验证的敏感性为85.1%。选用九个挥发性有机化合物的模型可用于成年吸烟者的高危人群肺癌的筛查。

这9个化合物是：

　　(3) 2005年国内学者用SPME-GC进行肺癌病人呼气的研讨

　　深圳作业技能学院的Hao Yu和浙江大学王平教授等于2005年在J Chromatogr B，2005，826：69–74上宣布研讨，用固相微萃取-气相色谱研讨15个肺癌病人和15个健康人的呼气中的有机挥发物特征。他们凭借前人的研讨(O,Nell 和M Phillips 等)，认为肺癌病人呼气中的有机物为癸烷、十一烷、苯、苯乙烯和丙基苯。用SPME-GC剖析这些化合物。

　　他们的实验分为三个部分。首先，对SPME萃取条件进行了优化;第二，用校准气体对气相色谱法进行评估，;第三把该办法应用于30人呼吸气剖析，其间15个是肺癌病人和别的15是比照的健康人。成果标明这一办法是一种潜在的非侵入性呼吸气查看肺癌筛查的办法。

　　他们运用岛津GC17A气相色谱仪-火焰离子化查看器(FID)，和DB-1毛细管柱(30m x 0.25mm id x 0.25mm膜厚)，程序升温从40坚持10min,再以5℃/min到150℃，最终在150℃坚持10 min。进样口温度为280℃，FID 温度为320℃。载气流量为1mL/min。

　　用SPME手动柄进行萃取，固定相为聚二甲基硅氧烷(PDMS 100μm膜厚)，萃取温度26℃，萃取时刻20 min。萃取后置于GC进样口，进样口温度320℃，以不分流形式进行剖析。图 5是呼吸气GC剖析的典型色谱图。

图 5 呼吸气GC剖析的典型色谱图

1-乙醇，2-苯乙烯，3-癸烷，4-十一烷

　　(4) 2007年浙江大学的研讨者用SPME-GC判定肺癌细胞中的有机挥发物

　　因为曩昔宣布的文章中,肺癌病人呼吸物中的成分专特点不够，所以作者们用顶空固相微萃取-气相色谱(HS-SPME-GC)办法对肺癌细胞在体外进行呼吸确诊，测定在培养基中靶细胞的挥发性有机化合物，包含不一样类型的肺癌细胞，如鳞状细胞癌细胞，腺癌，细支气管肺泡癌细胞，非小细胞癌细胞，支气管上皮细胞，味蕾细胞，成骨细胞，他们取得这些细胞的气味图谱。研讨标明，每一种类型的细胞具有共同色谱。

　　有4种特殊的挥发性有机物，存在于肺癌细胞的一切培养基中，这是代谢的肺癌细胞的产品，能够看作是肺癌的标志物。有11种特征生物符号物，见表4：

表 4 11种特征生物符号物

4 近几年国内院校的研讨

　　近几年国内有几座大学的研讨生挑选用呼吸气体确诊前期肺癌为研讨课题

　　2008年浙江大学卢崇蓉的硕士论文 ：搜集了30 例肺癌病人和30 例正常健康人的呼吸气体，选用固相微萃取和气相色谱剖析技能对呼吸气体中的VOCs 进行查看，经过将所测的各个组分，在色谱图中的出峰时刻和峰面积与制备的n 种规范气体样本比对，进行组分的定性定量剖析。对照剖析两组受试者呼吸气体中的VOC s ，开始挑选肺癌病人呼吸气体中的特征性VOCs。30 例肺癌病人中28 例查看出庚醛，其间2 例I期肺癌病人均查看出庚醛;30 例正常健康人中1 例查看出庚醛; 不一样病理类型的肺癌病人中都能够查看到庚醛，且庚醛的浓度在腺癌组和鳞癌组中无明显核算学区别。30 例肺癌病人中18 例查看出甲基环戊烷，30 例正常健康人中10 例查看出甲基环戊烷; 两组受试者呼吸气体中查看到的甲基环戊烷的浓度无显著性区别。庚醛也许为肺癌病人的特征性VOCs 之一。

　　安徽医科大学宋耕的硕士学位论文——肺癌病人呼气中痕量挥发性有机化合物的定量查看，他们用Tedlar 采样袋搜集43份非小细胞肺癌病人和41份正常人的呼气样品，经固相微萃取浓缩，用气相色谱-质谱查看呼气中的挥发性有机化合物，外标法定量。比照肺癌病人和正常人呼气中挥发性有机化合物的区别，成果在呼气样品中可查看出68-1 14种挥发性有机化合物，其间病例组的正丁醇和3-羟基-2-丁酮的色谱峰面积高于对照组。(安徽医科大学学，2008,43(3)：323-325)

　　暨南大学刘畅的论文，用z-Nose4300 气相色谱仪研讨了肺癌病人呼出气组分，发现乙醇、丙酮也许作为肺癌及肺转移病人的特异性VOCs，苯、异丙醇、二甲硫醚、异戊二烯、甲苯、正戊烷等挥发性有机化合物也许与肺癌有关。

　　浙江大学医学院博士研讨生胡燕婕的论文，以肺癌安排和肺癌细胞株为研讨对象，以正常肺安排和正常支气管上皮细胞株作为对照，使用SPME-GC-MS研讨肺癌与正常对照之间在安排细胞水平上VOCs表达的区别，用以探究肺癌特征性VOCs的产生机制。她们共查看剖析18例原发性肺癌病人的手术标本及几种细胞株培养液顶空气体中的VOCs，成果发现：2-十五烷酮、十九烷、二十烷、癸烷等12种VOCs在肺癌安排中高表达,其间2-十五烷酮、十九烷、二十烷与肺癌细胞株成果相符,提示上述物质也许为肺癌潜在的特征性标志物。( 浙江大学学报-医学版，2010，39(3)：278-284)

　　国内有许多单位和专家从事经过人呼吸气中生物符号物查看来确诊各种疾病的研讨。四川大学段忆翔教授近期有两篇总述文章触及这一范畴的研讨。(Clinica Chimica Acta，2012， 413： 1770–1780;J Chromatogr B, 2015，1002：285–299)

5 自己的观点

　　用呼吸气体确诊前期肺癌具有简便、无创、安全的特色，变成现在研讨热门。可是从各个研讨得到结论来看，因为生物化学变化的复杂性，在肺癌病人的呼气中得到的挥发性化合物也是非常复杂，没有几种肯定的生物符号物来进行确诊承认。显然不像用14C尿素呼气实验查看幽门螺旋杆菌办法那样单纯。所以用呼吸气体确诊前期肺癌的研讨，还有很多作业要做——找到几种非常专一的化合物来确诊承认肺癌，或另辟新的路径找到解决问题的办法。